肺部含有多種巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞群體，它們?cè)诜尾考膊≈衅鹬P(guān)鍵作用。準(zhǔn)確識(shí)別和計(jì)數(shù)這些亞群對(duì)于理解它們?cè)诜尾考膊≈械淖饔弥陵P(guān)重要。流式細(xì)胞術(shù)是研究免疫系統(tǒng)的主流工具。然而，尚未有系統(tǒng)的流式細(xì)胞學(xué)方法能夠在正常小鼠肺中準(zhǔn)確且一致地識(shí)別巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）亞群。在本研究中，我們開發(fā)了一套表面標(biāo)志物Panel和分析策略，能夠準(zhǔn)確識(shí)別肺中穩(wěn)態(tài)條件下所有已知巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞群體及其前體細(xì)胞。

肺臟包含多種固有免疫細(xì)胞：

肺臟樣品制備：

肺組織處理：

• 經(jīng)右心室灌注PBS后，剪碎肺組織，用膠原酶D（1 mg/mL）和DNA酶I（0.1 mg/mL）消化。

• 過40 μm尼龍篩，制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞。

• 臺(tái)盼藍(lán)染色排除死細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。

肺臟穩(wěn)態(tài)條件下圈門策略：

圈門步驟：

表面Marker：

• 單核/未分化巨噬細(xì)胞：CD11b? CD11c^(±) MHC II? CD64^(low) Ly6C^(hi/lo)

為驗(yàn)證準(zhǔn)確性，對(duì)各群細(xì)胞進(jìn)行了分選并做細(xì)胞涂片（Diff-Quik染色）：

• AM：偽足明顯，胞質(zhì)含空泡

• DC和IM：核不規(guī)則，胞質(zhì)多空泡

肺泡巨噬細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng)，易導(dǎo)致假陽(yáng)性，本組合通過多參數(shù)交叉驗(yàn)證避免誤判，克服了自發(fā)熒光干擾。CD11b? DC vs 間質(zhì)巨噬細(xì)胞，區(qū)別的關(guān)鍵在于 CD64? vs CD24?，區(qū)分易混細(xì)胞群體。相比之下，傳統(tǒng)“CD11b vs CD11c"雙參數(shù)設(shè)門法無法區(qū)分CD11b? DC、間質(zhì)巨噬細(xì)胞和未成熟單核細(xì)胞，且易將中性粒/嗜酸粒誤判為單核細(xì)胞。因此，這篇文獻(xiàn)，系統(tǒng)的給小鼠肺臟巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞文獻(xiàn)參考圈門解決方案。

原始文獻(xiàn)：

Misharin AV, Morales-Nebreda L, Mutlu GM, Budinger GR, Perlman H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;49(4):503-510. doi:10.1165/rcmb.2013-0086MA