Clodronate Liposomes體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除利器-靶點(diǎn)科技

去除巨噬細(xì)胞（depletion of macrophages）是研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije University?的Nico van Rooijen教授開發(fā)的一款Clodronate Liposomes，可以利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制，將膜不通透性的氯磷酸（clodronate）帶入細(xì)胞內(nèi)，氯磷酸被釋放，當(dāng)達(dá)到一定的濃度時(shí)可引發(fā)巨噬細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的。

作用原理

兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體，磷脂雙分子層中間通過水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過程中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中（如圖1）。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體的磷脂雙分子層。隨著脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬，在巨噬細(xì)胞溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來，并累積在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)其達(dá)到一定濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞將會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而進(jìn)入凋亡過程（如圖2）。從死亡的巨噬細(xì)胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細(xì)胞外的半衰期極短（大約15 min），可以通過泌尿系統(tǒng)排除體外。

圖2：巨噬細(xì)胞清除原理示意圖

產(chǎn)品屬性
1 mL脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5 mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，140 mM NaCl。

體內(nèi)注射方案
常見的注射方式是尾靜脈和腹腔。其他給藥方式，如鼻腔，氣管，眼眶后靜脈或者肌肉等，可以具體聯(lián)系國(guó)內(nèi)辦事處靶點(diǎn)科技，讓技術(shù)支持給方案，通過免疫組化或流式檢測(cè)巨噬細(xì)胞去除效率。

尾靜脈注射方法流程
（1）將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi)，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈，2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側(cè)的靜脈；
（2）將紗布浸泡于約70℃溫水中，拿出后包裹尾巴，以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的；
（3）行尾部靜脈注射時(shí)，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進(jìn)針，開始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入藥物。
（4）有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血。
注：以上操作方法和劑量使用僅供參考，不同的實(shí)驗(yàn)要求需自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案或是參考相關(guān)文獻(xiàn)。

常見問題（FAQ）

Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作？
A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后，如果不能馬上使用，需要放置在4℃冰箱。禁止凍存！使用時(shí)作為原液使用，不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用，需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射。

Q2:如何將脂質(zhì)體從小瓶中轉(zhuǎn)移出來？
A:從小瓶中轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的最佳方法是使用無菌針頭注射器。這樣小瓶中剩余的脂質(zhì)體懸浮液就可以保持密封和清潔。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但最好在潔凈的環(huán)境中進(jìn)行，例如在BSC罩中。

Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除？
A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除，但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中，從死亡細(xì)胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏"出來氯磷酸，會(huì)一直存在于培養(yǎng)基中，但是在體內(nèi)，氯磷酸的半衰期很短，很快就會(huì)被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞也不會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體，但是一旦他們?cè)谂囵B(yǎng)基中積累就會(huì)慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中。

Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動(dòng)物很快就死亡了，是什么原因？
A:一方面有可能是動(dòng)物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生沉降。如果在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)需要一次注射多只動(dòng)物，那么脂質(zhì)體便會(huì)在注射器中發(fā)生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，第一只注射的計(jì)量與最后一只注射的計(jì)量就會(huì)發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后，沒有恢復(fù)到室溫。

Q5:動(dòng)物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？
A：這個(gè)可能是受到細(xì)菌的污染，體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會(huì)增加例如病毒粒子，細(xì)菌或者酵母感染的幾率。

Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒有*消失？
A：大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+，但是呈現(xiàn)ED2-。因此，所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除，但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例。

Q7: Clodronate liposomes沒有達(dá)到期望的效果？

A：氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn)，每批次都會(huì)對(duì)氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測(cè)，確保無誤后才會(huì)銷售給客戶。另外，脂質(zhì)體容易收到超過40攝氏溫度的影響。正確的運(yùn)輸和儲(chǔ)存方式是4~8℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起，需要在3個(gè)月內(nèi)使用完，不然有可能會(huì)影響使用的效果。

Q8:在靜脈注射時(shí)，能不能增加注射的體積？

A：靜脈注射時(shí)需要依據(jù)動(dòng)物的體重，不能超過0.1 mL/10 mg，但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定。

Q9:使用脂質(zhì)體應(yīng)注意的一些事項(xiàng)？

A：通過具有飽和烴鏈的脂質(zhì)制備而來的脂質(zhì)體實(shí)際上非常堅(jiān)固，但仍需要注意以下一些事項(xiàng)。

①不要與有機(jī)溶劑混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、等有機(jī)試劑。

②不要添加表面活性劑，除非您必須要這樣做以裂解脂質(zhì)體。

③不要加熱、接近或高于脂質(zhì)主相轉(zhuǎn)變溫度，除非進(jìn)行藥物加載，這需要在相變溫度以上進(jìn)行孵育。